Analyse & purification des protéines : tout sur la chromatographie par échange d’ions (IEX)

Dans un article précédent, nous décrivions toutes les techniques chromatographiques dédiées aux analyses & purifications des protéines.
Cet article vise à se concentrer sur une technique spécifique : la chromatographie par échanges d’ions ou IEX

2 sortes d’IEX existent : CIEX ou Cation Exchange chromatography, AIEX ou Anion Exchange chromatography.

• Cation IEX : échanges de cations, échange de molécules chargées positivement
• Anion IEX : échanges d’anions, échange de molécules chargées négativement

Chromatographie par échanges d’ions :

La Chromatographie par échanges d’ions (IEX) sépare des molécules qui différent par leurs charges de surface. La technique permet des séparations avec de hautes résolutions et de grandes capacités de charges.
La séparation est basée sur une interaction réversible entre la protéine chargée et une résine chargée opposément.
La cinétique d’échange des IEX est très rapide ainsi de grands débits peuvent être appliqués.

L’IEX est préconisée quand vous devez obtenir une protéine de grande pureté (purification en 3 étapes) et ce, quelle que soit la protéine : anticorps, protéine recombinante ou protéine non marquée.

Principe de la chromatographie par échange d’ions

Les molécules sont séparées en fonction de leur charge de surface globale. La séparation depend du pH et de la force ionique (conductivité) de la phase mobile (éluant).

Avantages

• Grand débit, grande sélectivité
• Grande capacité
• Très haut rendement
• Concentration de l’échantillon

Inconvénients

• pH dépendant
• Protéines en concentration saline élevées en fin de purification
• L’échantillon doit être injecté à une faible concentration saline
• Présence de “paquets” de charges (+) peut générer une charge globale nette négative (-) de la protéine sur une résine échangeuse de cation et vice versa
• Le profil de séparation peut être modifié avec de faibles variations de pH
• La charge du tampon doit être la même que celle du mode IEX (Cation ou anion) pour ne pas interférer avec la molécule à purifier (si nous faisons un échange d’anion le tampon doit être chargé négativement et inversement pour un échange de cation)

Une résine échangeuse d’ions présente des groupements chargés

La résine peut être acide, la résine est une échangeuse de cations (échanges de molécules chargées positivement ) ou basique, la résine échange des anions (échanges de molécules négatives). Les résines cationiques et anioniques sont divisées en 2 sous classes, échange de cations (ou d’anions) faibles et forts, reflétant la force d’affinité.

Généralement, les échantillons sont chargés en tampons faiblement ionisés et élués avec des forces ioniques plus fortes par gradients en step ou linéaires.

De manière générale, une protéine se fixe sur une résine échangeuse de cation si le tampon est inférieur à son pI (point Isoélectrique – point pour lequel la surface globale net de la protéine est neutre) et à une résine échangeuse d’anion si le pH est supérieur à son pI.

Résine négative

Echange de cations Ligands: Sulfopropyl (SP) & CarboxyMethyl (CM)

Résine positive

Echange d’anions Ligands: Quaternary Amine (QA) & DiEthylAminoEthyl (DEAE)

Comment fonctionne l’IEX ?

L’IEX est fondé sur les interactions électrostatiques entre une molecule chargée et une résine chargée opposément. Résine et protéine doivent être de charges opposées et la protéine doit être totalement chargée. Pour cela, le pH de la solution doit différer du pI de la protéine d’au moins 2 unités.

Le pI de la protéine donnera le pH auquel nous travaillerons pour une adsorption totale de la protéine sur le support.

Technical tip
Ce sont les interactions électrostatiques, les répulsions, le nombre de charge et leur répartition à la surface de la protéine qui sont responsables de l’accroche de la protéine. Pas la charge net de la protéine.

Résine échangeuse de cations
pH acide < pI de la protéine : échanges de cations (la protéine est chargée positivement)		pH basique > pI de la protéine : échanges d’anions (la protéine est chargée négativement)
pH moins acide. Une protéine chargée négativement (bleu) inter-agit avec une résine anionique et peut être isolée. Alternativement, les autres protéines peuvent être séparées sur une résine cationique alors que la protéine bleue n’est pas retenue.		pH moins basique. Une protéine chargée positivement (rouge) inter-agit avec une résine cationique et peut être isolée. Alternativement, les autres protéines peuvent être séparées sur une résine anionique alors que la protéine rouge n’est pas retenue.
Résine échangeuse d’anions

Quels paramètres peuvent être modifiés pour améliorer une purification ?

IEX nécessite l’optimisation de la liaison des protéines et de l’élution pour obtenir une très grande pureté avec un grand rendement.
Nous pouvons jouer sur la concentration en sel et le pH.

Un gradient long à faible pente augmente la résolution

Sélectivité & élution
Gradient linéaire
Gradient step

Application

Méthode générique en gradient salin pour la caractérisation de 10 anticorps intacts	Méthode générique en gradient de pH pour la caractérisation de 10 anticorps intacts
Elution de tous les mAbs (pI entre 6.7 et 9.1), Il est possible de quantifier l’hétérogénéité des mABs et les quantités de variants acide/base S. Fekete et al., J. Pharm. Biomed. Anal., 2015, 102, 33-44	Performance similaire en gradient de sel et de pH. Les gradients de pH sont intéressants surtout dans l’industrie pharmaceutique pour éviter la préparation de tampon.